Desenvolvimento e caracterização de polimerossomos para veiculação de L-asparaginase / Development and characterization of polymersomes for the release of L-asparaginase

A enzima L-Asparaginase (ASNase) é um biofámaco utilizado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda, no entanto, a evolução da produção da ASNase como um medicamento desde o final da década de 1970 resultou em apenas quatro alternativas disponíveis no mercado farmacêutico, com relatos de graves reações imunogênicas e toxicidade. Desse modo, a nanotecnologia é uma plataforma que pode ser explorada para administração dessa enzima diminuindo a exposição da mesma a proteases e aumentando a sua meia-vida aparente. Os polimerossomos (PL) são opções que pela nanoestrutura vesicular poderiam encapsular a ASNase em seu core aquoso e pela presença de uma membrana polimérica, são mais robustos que os lipossomos. Assim, neste trabalho objetivou-se desenvolver PL para encapsulação da ASNase como uma alternativa às formulações deste biofármaco existentes. Foram desenvolvidos PL de PEG-PLA, PMPC-PDPA, PEG-PDPA e Pluronic® L-21. Foram estudados fatores relacionados à composição dos copolímeros (fração hidrofílica, responsividade a fatores externos tais como pH e temperatura) e métodos de elaboração (hidratação do filme polimérico, troca de pH e temperatura) bem como foi feita a caracterização dos PL obtidos (tamanho, índice de polidispersão, espessura de membrana, formação de excessivo bulk polimérico, obtenção de micelas). Também foi feito um planejamento racional para encapsulação da ASNase (hidratação direta do filme polimérico e encapsulação por eletroporação, autoagregação com encapsulação por troca de pH ou de temperatura). Para os PL preparados com PEG-PLA, a extrusão resultou em distribuição de tamanhos mais estreitos correspondentes aos valores de PDI de 0,345, 0,144 e 0,081 para PEG45-PLA69, PEG114-PLA153 e PEG114-PLA180, respectivamente. Foi demonstrado que copolímeros com menor fração hidrofóbica resultam em maior eficiência de encapsulação para proteínas, já que possuem volumes aquosos maiores. Com o PMPC25-PDPA72 foi possível encapsular em média três unidades de ASNase por vesículas através da eletroporação ou troca de pH, sendo que no primeiro método houve formação de túbulos e no último método as micelas não foram completamente removidas. Para PEG100-PDPA80, grandes agregados permaneceram após a purificação levando a um PDI alto, mas não foi observada a formação de túbulos, já a troca de pH para este copolímero resultou em maior perda de copolímeros como bulk polimérico precipitado. Para o copolimero tribloco Pluronic® L-121, foi observado que as vesículas eram estáveis durante uma semana à temperatura ambiente, contrariando o que era descrito na literatura. Nesses sistemas, quando preparados por hidratação do filme, a encapsulação da ASNase foi realizada por eletroporação mas a proteína não foi detectada dentro das vesículas. Atribuímos a não-encapsulação à organização da bicamada Pluronic® L-121 sem conformação definida das cadeias poliméricas, dificultando a reorganização do bloco hidrofílico na porção interna do poro durante eletroporação. Por troca de temperatura, cerca de 5 % de ASNase foi encapsulada e o método resultou em total recuperação da atividade da enzima. Desse modo foram obtidos diferentes PL com diferentes características nanoestruturais de acordo com os copolímeros utilizados para carreamento da ASNase

The enzyme L-Asparaginase (ASNase) is a biopharmaceutical used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, still the industrial production of ASNase as a marketable drug since the late 1970s has resulted in only four alternatives available in the pharmaceutical market, with reports of severe immunogenic reactions and toxicity. In this sense, nanotechnology is a platform that can be exploited to administer this enzyme by decreasing its exposure to proteases and increasing its apparent half-life. Polymerosomes (PL) are interesting routes which by its intrinsically vesicular nanostructure could encapsulate the ASNase in its aqueous core and by the presence of a polymeric membrane, being more robust than the liposomes. Thus, in this work it was intended to develop PL for ASNase encapsulation as an alternative to existing formulations of this biopharmaceutical. PL of PEG-PLA, PMPC-PDPA, PEG-PDPA and Pluronic® L-21 were developed. It was studied the copolymers composition (i.e. hydrophilic fraction, responsiveness to external factors such as pH and temperature), PL design (i.e. polymer film hydration, pH change and temperature) and PL characterization (i.e. size, polydispersity index - PDI, membrane thickness, formation of excessive polymer bulk, micelles production). A suitable experimental planning for ASNase encapsulation (i.e. direct hydration of the polymeric film and encapsulation by electroporation, self-aggregation with encapsulation by pH or temperature change) was also performed. For the PL prepared with PEG-PLA, the extrusion resulted in narrower size distribution corresponding to the PDI values of 0.345, 0.144 and 0.081 for PEG45-PLA69, PEG114-PLA153 and PEG114-PLA180, respectively. It has been shown that copolymers with lower hydrophobic fraction result in higher encapsulation efficiency for proteins, since they have larger aqueous volumes. With PMPC25-PDPA72 PL, it was possible to encapsulate three units of ASNase per vesicles through electroporation or pH change. In the first method, tubules were formed and in the latter one the micelles were not completely removed. For PEO100-PDPA80 PL, large aggregates remained after purification leading to a high PDI value, nevertheless no tubule formation was observed, since the pH change for this copolymer resulted in greater loss of copolymers as a precipitated polymer bulk. For the Pluronic® L-121 triblock copolymer PL, it was observed that the vesicles were stable for one week at room temperature, contrary to what was described in the literature. These PLs were prepared by film hydration method and ASNase encapsulation was performed by electroporation, nonetheless the protein was not detected within the vesicles. It is attributed the non-encapsulation to the organization of the Pluronic® L-121 bilayer without defined conformation of the polymer chains, making it difficult to reorganize the hydrophilic block in the internal portion of the pore during electroporation. By temperature change, about 5% of ASNase was encapsulated and the method resulted in complete recovery of enzyme activity. In conclusion, several PLs with a vast range of differential nanostructural characteristics were obtained according to the copolymers used for ASNase loading

Evaluation of adhesive properties of presumptive probiotic Lactobacillus plantarum strains / Avaliação das propriedades de adesão de presumíveis estirpes probióticas de Lactobacillus plantarum

Thirty-two strains of Lactobacillus plantarum UFLA SAU from pork sausages, pre-selected for some features for probiotic application, were utilized in this study to evaluate their adhesive properties and compare the results against the three pathogens also tested. Strains were tested for autoaggregation and coaggregation capacity and Microbial Adhesion To Solvents (MATS) at the time intervals of 0, 1, 2, 3 and 4 h. Our findings revealed that UFLA SAU strains have a high autoaggregative capacity and coaggregative ability with pathogens, especially Listeria monocytogenes. In relation to adhesion to solvents, in general, L. plantarum strains showed hydrophilic cell surface properties and an important electron donor and basic character. Adhesive properties were markedly separated for the strains under study by Principal Component Analysis software. UFLA SAU 132, 226 and 87 were differentiated by autoaggregation ability. UFLA SAU 11 and Listeria monocytogenes were characterized by adhesion to solvents. UFLA SAU 14, 18 and 172 showed high coaggregation with Escherichia coli, Salmonella Typhi and Listeria monocytogenes. In comparison to the pathogens tested, many UFLA SAU strains presented higher adhesive capacity. These tests should be used for screening and identifying potentially adherent microorganisms. Adhesive properties are important features for the choice of probiotic strains and confer various applications, such as in the pharmaceutical (therapeutic or prophylactic) and food (functional foods) industries.

Trinta e duas estirpes de linguiça suína, Lactobacillus plantarum UFLA SAU, pré-selecionadas com algumas características para aplicação probiótica, foram utilizadas neste estudo para avaliar suas propriedades adesivas e comparar os resultados com três patógenos também testados. As estirpes foram testadas para autoagregação, coagregação e capacidade de adesão microbiana aos solventes (MATS) nos tempos de 0, 1, 2, 3 e 4 h. Nossos resultados revelaram que estirpes UFLA SAU apresentam alta capacidade autoagregativa e coagregativa com patógenos, especialmente com Listeria monocytogenes. Em relação à adesão aos solventes, de um modo geral, as estirpes de L. plantarum mostraram propriedades hidrofílicas de superfície celular e um importante caráter básico e elétron doador. Propriedades adesivas foram marcadamente separadas para as estirpes em estudo através da Análise de Componentes Principais. UFLA SAU 132, 226 e 87 foram diferenciadas pela capacidade de autoagregação. UFLA SAU 11 e Listeria monocytogenes foram caracterizadas por adesão aos solventes. UFLA SAU 14, 18 e 172 apresentaram coagregação com Escherichia coli, Salmonella Typhi e Listeria monocytogenes. Em comparação aos patógenos testados, muitas estirpes UFLA SAU apresentaram maior capacidade adesiva. Estes testes podem ser úteis para a triagem e identificação de micro-organismos potencialmente aderentes. Propriedades adesivas são importantes características para a escolha de estirpes probióticas e conferem várias aplicações, tais como nas indústrias: farmacêutica (terapêutico ou profilático) e de alimentos (alimentos funcionais).